第五章 临床生化诊断试剂盒的选择与评价
第一节 重点解析
一、试剂盒的分类和特点
商品试剂与标准液按检测项目组合成一套放在一个包装盒内叫试剂盒，或叫试剂组合。
1.液体型试剂
(1)液体单试剂 所谓液体单试剂就是将某种生化检验项目所用到的试剂科学地混合在一起，组成为一种试剂。应用时，只须将标本和试剂按一定比例混合，即可进行相应的生化反应，然后用适当的方法检测结果。应用十分方便。
(2)液体双试剂 所谓液体双试剂就是将某些生化检测项目所用到的试剂，按用途科学地分成两类，分别配成两种试剂，通常第一试剂加入后可起到全部或部分消除某些内源性干扰的作用，第二试剂为启动被检测物质反应的试剂，两种试剂混合后才共同完成被检项目的生化反应。然后用适当的方法检测结果。
2.粉(片)剂型试剂
所谓粉剂型及片剂型试剂，即是将试剂的各组分用球磨技术粉碎成粉剂或混合后压成片剂，使用前再加入指定的溶液复溶成液体试剂。
干粉试剂如果用固体原料研磨后制成粉剂或片剂，则存在许多问题：①要使试剂各组分混合得非常均匀，技术难度很大;②分装过程中的称量误差及复溶时加水量的准确性影响试剂的瓶间差;③水质优劣对试剂的稳定性和测定的可靠性有相当大的影响。
3.其它类型试剂
(1)快速反应试剂盒 主要是加大效应酶用量缩短反应时间，提高工作效率,是一种发展趋势。
(2)一步法试剂盒 这是利用特异性抗体参与反应的新型试剂。
(3)多项同测组合试剂盒 这类型试剂主要是用于三点双项同测终点法、三点双项同测连续监测法和三点双项同测终点速率法测定的试剂盒。方法是在同一比色杯中，先后加入两种试剂与检品中的两种被检物发生反应，在各反应达到平衡期时分别测定，整个测定过程进行三次比色，测定两个项目，称为三点双项同测终点法。
(4)卡式试剂盒 试剂首先装入试剂瓶，瓶上充分使用编码技术，而后根据编码启动调配、使用及更换储存。其特点是：①卡式试剂瓶上条码令使用者可快捷准确地输入试剂数据，如测试数量、批号、有效期，保证正确识别试剂。②试剂装载后能自动调配，可消除潜在误差，并节省操作时间。③持续不断地监察仪器上已装载的试剂存量，并在供应量不足时通知使用者。试剂装载使用时间可长达一个月。④所有卡式试剂盒大小划一，有利储存。卡式试剂设计较独特，可防止试剂蒸发及降解，能确保试剂装载后的稳定性更长，从而节省成本。⑤标签根据测试类别以颜色编码，便于使用者识别。
(5)浓缩试剂盒 上述卡式试剂盒就是采用的浓缩试剂，使用时自动完成稀释，而后用于测定。浓缩试剂便于工作、储存、运输、装载等优越性是很明显的，浓缩试剂便于监控、减少校正次数、提高工作质量。
二、液体双试剂盒的特点
液体双试剂与其它类型试剂比较具有液体试剂和双试剂的优点。
1.提高了抗干扰反应的能力 在临床生化测定过程中，血标本除了含有待测物质外，还含有各种酶、有机物、无机盐等物质，这些物质都会干扰或参与测试反应，引起非特异性反应干扰，而双试剂型试剂盒设计的一个主要目的就是为了克服这种干扰反应。在测定过程中，首先让试剂Ⅰ与标本中的干扰物质反应，反应5分钟后，再用试剂Ⅱ启动真正的测试反应，从而使测定结果更加准确。
2.使测定更科学合理 由于液体双试剂的使用，使测定更加科学合理。
3.稳定性能优良 全液体酶法试剂从分配上解决了干粉、片剂型复溶后稳定性的影响：①用户可根据每次标本量多少按一定比例配制适量工作液，当天配制当天用完，这样便可减少试剂损失。②如果用户使用的自动生化分析仪有双试剂测定功能，那么，就不必把双试剂混合成工作试剂进行测定，试剂的有效期一年便是工作液的有效期。
对于干粉、片剂型等需复溶的生化试剂，水质的好与坏直接影响了复溶后工作液的稳定性和测定重复性。如①水中F会引起某些酶失活;②水中的重金属离子会影响酶活力;③水中某些微生物会引起酶失活，除了水中某?quot;杂质"会引起试剂中酶失活、部分失活而导致稳定性、重复性下降外，有些"杂质"会直接影响测定结查，如水中含有NH4便会直接影响尿素氮测定的准确度。
4.试剂组分高度均一 试剂中每一组分均一性是影响试剂测定重复性的一个重要因素。在干粉、片剂与冻干生化试剂生产过程要使每一试剂中十几种组分(有的组分含量相当微量)分布相对均匀也是一个技术难度较高的课题。在每一种试剂生产过程中必须解决：①原料干粉生产过程中每一组分的均匀性(冻干生化试剂在冻干分装前由于是液体的，每个组分是相当均匀)。②在分装过程中由于加样误差引起的均匀性问题。③在使用过程中，由于需加入复溶水，复溶水的加样误差也会造成瓶与瓶之间同一组分浓度不尽一样。
三、临床生化诊断试剂的制备
1.标准品的制备
(1)标准物质应具备的条件 必备的主要条件∶ ①纯度高;②定值准确可靠;③稳定性好，在保管、使用有效期内其示值误差不超出证书的许可范围;④均一性好，任何一份分装的小样品都具备整个标准物质的特性指标。附加条件∶ ①摩尔质量尽可能大;②具有符合使用目的之反应特性;③制造简便，价格低廉，购买方便;④标准物质的组成若发生变化(如吸潮)时，可采用重新干燥(恒重)等措施使其复原。
(2)标准液的配制 标准液配制的依据∶ 供临床生化常规测定用的标准液属于二级标准物质，其示值的准确性对检验质量有重大影响，必须在标准物质选择、恒重方法程序、基质(包括水)的质量、最优化的配方和制备工艺上都要严格按照我国卫生部医政司主持编写修订的《全国临床检验操作规程》(1997年5月，第二版)的要求进行。标准液的质量鉴定∶ 不论是实验室自行配制或厂家生产的标准液，都需要认真地按照国家卫生部的规定做好质量检定。提出的规范化的要求和质量检定标准，并在标准液制备过程中应该严格检定程序，使其达到质量标准。
(3)标准液的正确使用 ①应采购诊断试剂正规生产厂家生产的商品标准液，尤其有国家卫生部生产文号的产品。②一瓶标准液只能使用一次，避免反复冻融、反复使用，尤其是标准物质稳定性较差的标准液(如尿素、葡萄糖、胆红素、白蛋白等)以及标准液的基质易挥发的标准液(如用无水乙醇配制的胆固醇标准液等)更应注意。③定值质控血清只能用于临床生化室内质量控制及室间质量评价，不能用作常规分析的标准物质，也不能用于相应物质含量的标化或仪器分析性能准确性的评价。④按照各种标准液不同保存条件妥善保管，并在其有效期内使用。
2.试剂中常用工具酶的质量保证
工具酶是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性的一类酶。它是酶试剂
的核心，它的质量是酶试剂质量的决定性因素。酶试剂方法已成为最有发展前途的分析方法。
临床生化酶试剂中的工具酶主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。微生物发酵工程包括高产酶菌种的筛选、放大培养和酶提取纯化三个部分。
为了更有效地发挥工具酶的催化效能，形成最佳的酶试剂配方，必须确切地掌握该酶对底物的专一性、分子量、等电点、Km、最适pH、最适温度等理化特性参数，并熟悉辅助因子、激活剂和抑制剂对酶活性的影响。
工具酶的纯度一般用酶的比活性和杂酶含量来表示。 酶的比活性是评价酶纯度的最好标准，即每毫克(酶)蛋白所具有的酶活性(U/mg)。酶的比活性越高，酶的纯度越高。为了兼顾工具酶的较低生产成本和保证酶试剂质量，对工具酶中容易引起副反应的其他酶(即所谓杂酶)含量提出了"允许限度"的要求。
3.缓冲液的配制
缓冲液是临床生化诊断试剂的重要组成部分。缓冲液维持pH恒定的效力取决于其缓冲容量的大小。缓冲容量是指使1L溶液的pH改变个1pH单位所需要的酸或碱量(mol)。缓冲容量决定于盐与酸(或碱)的真实浓度及两者的比值。缓冲液的浓度越高，缓冲容量越大。一般的缓冲液总浓度在0.05～0.2mol/L之间。当总浓度固定时，盐与酸(或碱)的比值为1时，其缓冲容量最大;如果两者比值相差10倍以上时，则缓冲容量将大为减小。在实际工作中，不能无限制地加大缓冲液的浓度来增加其缓冲容量，因为盐类浓度过高将抑制酶的活性，对电泳分离也有不利的影响。
配制缓冲液注意的事项为 ①所有试剂最好选用分析纯或优级纯，并必须恒重后方能配制。②所用仪器必须清洁，容量仪器最好经过校正，以保证准确。③配好的缓冲液必须用酸度计校正其pH值(准确至小数点后两位)。如对其浓度有怀疑时，则应用滴定法检查其浓度。
四、临床生化诊断试剂盒的选择
(一)试剂盒的性能指标
1.准确度 通常以回收率、定值血清的靶值范围、对照试验及干扰试验的结果来判断。
(1)回收试验 回收率越接近100%，准确率越高，一般以100%±5%为合格。
(2)定值血清的测定 对于某些无法准确加入标准物的试剂盒，可用低、中、高浓度的定值血清进行测定，测得值符合定值血清的靶值范围( ±2S)为合格。
(3)对照试验 将被检试剂盒与公认的参考方法同时测定若干样本(一般要求100份，最少需30份)，计算两组结果的相关系数和直线回归方程。相关系数γ越接近1.0、斜率b越接近1.0，截距a越接近0，则准确度越高。相关系数要求在0.9～1.0之间，γ值符合要求不等于准确度都符合要求。b表示比例偏差，a表示恒定偏差。(1-b)×100%表示比例偏差的大小。(a值/样品含量)×100%表示恒定偏差的大小。
(4)非特异性与干扰试验 对维生素C、黄疸、溶血、乳糜等因素的耐受程度，干扰值越小越好。
2.精密度 试剂的瓶间差异、批内精密度和批间差异三组测定的平均值之间应无显著差异，否则，试剂盒的均一性不符合要求。
(1)瓶间差异 同一试剂盒，取10瓶试剂复溶，测定同一样品的含量，求平均值、标准差、变异系数。
(2)批内精密度 同一样品用同一瓶试剂测定10次，求平均值、标准差、变异系数。
(3)批间差异 同一样品，用不同批号的10瓶试剂测定，求平均值、标准差、变异系数。
3.线性范围 指该试剂盒按其说明使用时可准确测量的范围。被检样品的含量超出测定线性范围，必须改变样品与试剂体积的比例，重新测定才能得到准确结果。试剂盒的测定线性范围是衡量试剂盒质量的一个指标，也是正确使用该试剂盒的关键之一。试剂盒测定线性范围要求能覆盖该项测定的常见医学决定水平。
4.抗干扰作用 双试剂型试剂盒主要优点是抗干扰作用。如ALT双试剂盒的第一试剂能排除内源性丙酮酸干扰。此种试剂盒的第一试剂加入被检血清后，37℃5分钟内显示NADH被消耗、340nm吸光度值下降的曲线，当内源性丙酮酸被消耗完，吸光度曲线平坦，加入第二试剂后，340nm吸光度立即上升，当ALT酶促反应发生后又下降。这种反应曲线显示了ALT双试剂具抗干扰作用。甘油三脂测定双试剂的排除游离甘油的作用，可加入甘油标准液后进行试验，以证实排除游离甘油的能力。
5.灵敏度 在终点法灵敏度以特定波长下1cm光径时单位浓度的吸光度值表示，如胆固醇酶法测定试剂盒要求其灵敏度A500nm0.005时的胆固醇浓度相当于0.08mmol/L。连续监测法以特定波长下1cm光径单位酶活性的吸光度值表示，试剂盒质量合格时，其灵敏度值与理论计算的ΔA/min×因数值一致。试剂盒的质量与灵敏度密切相关，灵敏度达不到要求的试剂盒不宜使用。
6.稳定性 试剂盒稳定性是指试剂盒在规定条件下储存仍保持其性能指标的期限。
(1)原包装试剂的稳定性 按说明书的保存方法储藏，于不同时期取出一瓶复溶，测定试剂吸光度值、标准品含量、定值血清含量、线性范围、酶促反应时间曲线或化学反应速度时间曲线及其他性能指标，直到这些指标变化超出规定值的10%以上的期限，为原包装试剂的稳定期。
(2)复溶后试剂的稳定性 将复溶试剂分别放在4℃、25℃保存，逐日与新复溶试剂对比，观察上述指标，直到测定结果与新复溶试剂的差值>10%以上，这一期限为复溶后试剂的稳定期。
(3)不同温度下的保存期 将原包装试剂盒置25℃、37℃、45℃、4℃保存，以出现说明试剂变质的指标来确定在不同温度下的保存期。
(二)选购试剂盒的要求和注意事项
1.选购试剂盒的一般要求
(1)所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合卫生部临床检验中心、IFCC、WHO等推荐的方法性能。
(2)试剂盒的储存期至少为1年。
(3)水溶性、低粘性、无腐蚀、无毒害、不爆炸、不易燃、不污染环境。
(4)所用标准品或标准参考物符合卫生部临床检验中心、IFCC、WHO推荐的标准和要求。
2.选购试剂盒的注意事项
(1)首先要仔细阅读试剂盒的说明书，对试剂盒选用方法有所了解，科学研究工作时应选择参考方法试剂盒，医疗预防工作应选择推荐的常规方法试剂盒，或选择公认的测定方法试剂盒。此外，对试剂盒的组成、方法性能指标加以分析，是用于手工操作，还是用于自动分析仪。属于后者，其实验参数是否与本单位自动分析仪的实验参数相符。
(2)有无卫生部的批准文号。凡已列入卫生部临床检验体外诊断试剂审批管理范围的试剂盒，没有生产批准文号的，不应使用。对有生产批准文号者，也需考察生产厂家的信誉。
(3)对试剂盒的包装、理学性能、方法学性能指标进行考察和检测，并经实际应用。符合说明书规定及本室实验要求者方可选购。
(4)根据本单位的日工作量、分析仪试剂用量、试剂复溶后4℃稳定期等因素综合分析，应选购合适包装，近期出厂的产品。
(5)注意季节对试剂质量的影响。一般在气温较低的季节购买试剂，防止试剂盒在运输途中变质。
(6)在确保试剂盒质量前提下，应选购价格低的产品。
五、试剂盒的性能评价方法
1.说明书审查 审查内容包括：①试剂名称;②用途;③测定原理和技术要求;④试剂盒内的包装内容;⑤适用仪器;⑥标本要求;⑦测定步骤及注意事项;⑧贮存的条件及有效期;⑨性能特征，包括准确度、精确度、特异性、受干扰的程度、线性范围、参考范围;⑩生产单位名称、地址、邮编及电话。
2.理学检验与评价 理学检验的内容有：①外包装应完整牢固，封口严密，标签清晰;②有详细的用户说明书，卫生部批准的生产文号，生产日期，有效期和保存条件;③粉剂型应均匀无凝块，不粘附瓶壁;④液体型试剂应无沉淀，无混浊，无渗漏;⑤复溶后或液体试剂的pH应符合标准规定。
3.性能指标的检验与评价
(1)线性范围的测定 试剂盒的线性范围，既是衡量其质量的重要指标，也是保证正确使用和鉴定试剂盒的关键指标之一。一旦线性范围变窄即应废弃。造成线性范围变窄的原因常见的有：①生产中组份投料量不足;②生产后组分稳定性差;③运输和贮存不当等。
2.观察时间反应曲线
(1)终点法 ①试剂空白的吸光度是否符合规定标准，否则会影响测定的精密度和准确度;②试剂空白的时间反应曲线应平坦，且无明显波动，否则，说明试剂本身不稳定，会导致测定偏差;③反应能否在规定的时间内达到平衡，达到平衡的时间应在终点法读取测定吸光度的时间之前。反应速度慢的原因，常为试剂中酶量不足或酶质量不好，或反应条件不是最适条件;④反应达到平衡后，吸光度最大并维持不变，这一期间为反应平衡期，终点法测定应在这一期间读取吸光度。
(2)连续监测法 ①试剂空白值是否符合规定，吸光度下降型的反应，试剂空白吸光度应在1.5左右，吸光度上升型的试剂空白吸光度越低越好，不符合说明书中规定值者不宜使用;②试剂空白的时间反应曲线应平坦，吸光度变化(△A/min)应≤0.001，若大于此值，表明试剂本身分解变化，会使测定结果产生误差;③延迟期、线性反应期与设定的实验参数是否相符，若不相符应予修改;④观察时间反应曲线的斜率，通过定值血清，分析试剂盒的灵敏度。当试剂盒中底物浓度不足，辅助酶或指示酶的酶量不足或质量不好，反应条件不是最适条件等情况时，时间反应曲线斜率下降，灵敏度低，测定结果有严重比例误差，这种试剂盒无法纠正，不能使用。
3.稳定性试验 评估试剂盒的稳定性应包括原包装和工作液在试剂盒指定条件下的稳定性。试剂盒的稳定性与贮存条件密切相关，工作液的稳定性还和使用中污染与否有关，在评估时，须保持指定贮存条件并要严防污染。
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