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　　1、范围

　　本标准规定了血小板计数参考方法的技术要求。

　　本标准适用于建立血小板计数参考方法的实验室。

　　2、规范性引用文件

　　国际血液学标准化委员会（ICSH）-2001血小板计数的参考方法

　　3、定义

　　参考方法（Referencemethod）

　　一种可清楚和准确描述的用于特定检测的技术，该技术要有依据，可提供足够准确和精密的实验数据以评价其他实验方法检测结果的有效性。若有决定性方法，参考方法的准确性必须与决定性方法进行比较。参考方法应溯源至一级计量标准并且须标示不准确度和不精密度。

　　4、总则

　　4.1本标准采用间接法计数血小板（Platelet，PLT）。即用荧光标记PLT后，用流式细胞仪检测红细胞（Redbloodcell，RBC）和PLT的比值，同时用单通道阻抗原理的半自动细胞计数仪准确计数RBC，用RBC除以RBC和PLT的比值得出PLT的计数值。

　　4.2为了保证参考方法检测结果的精密度和准确性，建立参考方法的实验室必须进行比对。

　　5、血小板计数参考方法的原理

　　首先将EDTA抗凝血标本用无菌缓冲液进行预稀释，再用特定的荧光抗体对PLT进行染色。溶液中已染色的血小板被稀释成计数浓度，用流式细胞仪检测血小板和红细胞，根据荧光强度和散射光强度将阈值设在可从RBC中区分PLT的位置，以检测出RBC和PLT的比值。用RBC的计数值除以RBC/PLT的比值计算出PLT计数值。

　　6、血标本

　　6.1用合乎要求的塑料注射器或真空采血系统采集健康人的静脉血标本。

　　6.2标本的收集要求使用EDTA二钾为抗凝剂，抗凝剂的浓度为3.7至5.4umol/ml血（1.5～2.2mg/ml血）。

　　6.3盛有标本的试管应有足够的剩余空间以便于血标本的混匀操作。

　　6.4标本中不能有肉眼可见的溶血或小凝块。医学教|育网搜集整理

　　6.5标本置于18℃～22℃室温条件下，取血后4小时之内完成检测。

　　6.6为了保证RBC和PLT分布的均一性，在预稀释和加标记抗体前动作轻柔地将采血管反复颠倒，充分混匀标本。勿使用混匀器对标本进行混匀。

　　7、容器和器皿

　　为避免血小板黏附于储存容器或稀释器皿上，在标本检测的整个过程中必须使用聚丙烯或聚苯乙烯容器，不得使用玻璃容器和器皿。

　　8、仪器的性能

　　8.1使用流式细胞仪，通过前向角散射光和荧光强度来检测PLT和RBC.仪器在检测异硫氰酸荧光素标记的直径为2μm的球形颗粒时必须有足够的敏感度。

　　8.2用半自动、单通道、阻抗原理的细胞计数仪检测RBC，仪器小孔管的直径为80～100μm，小孔的长度为直径的70%至100%，计数过程中吸入稀释标本体积的准确度在1%以内（溯源至国家或国际计量标准）。

　　9、试剂

　　9.1稀释液：用磷酸盐缓冲液（PBS）作为稀释液，浓度为0.01mol/L，pH值7.2～7.4，含0.1%的牛血清白蛋白（BSA），配制方法如下：

　　9.1.1将1.15g无水磷酸氢二钠（Na2HPO4；化学分析纯，；分子量为142.0）加到约750ml去离子水或蒸馏水中并使之溶解。

　　9.1.2向210mg磷酸二氢钾（KH2PO4；化学分析纯，分子量为136.1），8.0g氯化钠（NaCl；化学分析纯，分子量为58.44），200mg氯化钾（KCl；化学分析纯，分子量为74.55）和1.0gBSA的混合物中加入去离子水或蒸馏水至1000ml.保存于4℃～8℃条件下。

　　9.1.3用低附着性的平均孔径在0.20～0.25μm之间的滤膜过滤。

　　9.2染液：使用异硫氰酸荧光素标记的CD41和CD61抗体，这两种抗体可以与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa复合物结合，用于检测血小板。

　　实验室应确认该批号抗体是否能得到足够的染上荧光的血小板。抗体应能得到足够高的血小板的荧光信号以便通过logFL1（528nm处的荧光强度）对logFS（前向角散射光）的图形分析，将血小板从噪声、碎片和RBC中分辨出来。

　　10、检测过程

　　10.1用加样器加5μl充分混匀（至少轻柔颠倒标本管8次）的血标本于100μl已过滤的PBS-BSA稀释液中。

　　10.2加5μlCD41抗体和5μlCD61抗体染液，在室温18℃～22℃、避光条件下放置15分钟。

　　10.315分钟后，加4.85mlPBS-BSA稀释液制备成1：1000的稀释标本，轻轻颠倒混匀以保证PLT和RBC充分混匀。

　　10.4用流式细胞仪检测时，应至少检测5000个信号，其中PLT应多于1000.流式细胞仪的设定必须保证每秒计数少于3000个信号。如果同时收集到RBC散射光的信号和血小板的荧光信号应被视为RBC-PLT重叠，计数结果将被分别计入RBC和PLT.

　　直方图或点图均可被采用，但推荐使用点图。检测过程中推荐使用正向置换移液器。

　　11、RBC浓度的计数法

　　据中华人民共和国卫生行业标准WS/TXXX-2003：红细胞和白细胞计数的参考方法。

　　12、血小板计数值的确定

　　使用流式细胞仪确定RBC/PLT的比值

　　R=RBC/PLT

　　用RBC数除以R值得到PLT计数值

　　13、重叠

　　一旦设定了理想的检测条件，则不须再次进行重叠计数的校准。

　　14不精密度

　　血小板检测结果的不精密度（CV）要求≤3%。