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第二章 临床生物化学实验技术

一、光谱检验技术
利用各种化学物质都具有发射、吸收或散射光谱谱系的特征，以此来确定物质性质、结构或含量。在临床生物化学检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。它既可以研究物质的结构分析，也可以对特定物质进行定性或定量的分析根据物质对光谱响应特征的不同，可把光谱检验技术分为发射光谱分析技术、吸收光谱分析技术和散射光谱分析技术三大类。
可见-紫外光分光光度法利用朗伯－比尔定律作为化学反应定量的基础，应重点掌握该定律的应用、使用条件和各个变量间的关系，从而根据已有的结果计算需要的变量。
吸光系数是表示物质特性的常数，是物质鉴定的基础，根据物质的吸光系数可以进行定量测定，但应注意其使用的条件。在化学反应中尽量选择吸光系数大的物质，可以提高测定的灵敏度。
在分光光度法的建立中，应掌握波长的选择、双波长测定的原理和抗干扰的原理。在可能的情况下应选择灵敏度高、选择性好的显色剂，同时需要应用适当的校准方式和计算方程式。
在定量分析中，大量使用分光光度计。该类仪器属于比较精密的分析计器，使用要求比较严格。其中单色光的纯度和波长的准确性直接影响到测定结果的准确性和精密度。在使用前和使用过程中应进行光源的检查和波长的校正。
原子吸收分光光度法是基于光源辐射出具有待测元素特征谱线的光，通过原子化器，被其中待测元素的基态原子所吸收，根据吸收而导致辐射特征谱线光被减弱的程度来测定待测元素的含量。与其它分析方法比较，它具有灵敏、准确、分析速度快、干扰少、无需化学反应和测量元素含量范围较广等优点。由于其检测灵敏度较高，操作环节比较多，而且每种元素需要一种的光源灯，因此在临床实验室一般较少应用于常规分析。
荧光分析法是利用某些物质吸收了一定波长的光能后，分子从基态跃迁到激发态，此类电子经与同类分子或它种分子相互碰撞，消耗相当，而下降至第一电子激发态的最低振动能阶。最低能阶下降到基态，同时发射出比原来所吸收的频率较低，波长较长的光能，称为荧光。利用元素的原子所发射的共振荧光波长的差异，可确定元素的种类或物质分子中某种结构，从荧光的强弱可以测定物质的含量。荧光分析定量是基于荧光物质的稀溶液，在一定的温度下，当激发光的波长、强度、荧光测定波长以及液层厚度一定时，所测得的荧光强度F与该溶液中荧光物质的浓度C成正比，F=kC。采用标准曲线法或直接比较法，对荧光物质进行定量。 荧光分析法灵敏度高，可以进行微量分析和定量测定较微量的物质。但该方法影响因素较多，因此，在进行荧光分析时应严格控制各种条件才能获得灵敏、准确的分析结果。

二、电化学分析技术
电化学传感器在临床生化分析的应用中占据着主导的地位。其原理是将电极浸入待测溶液中组成原电池，其中一支电极的电极电位与待测离子的活度有关，其关系服从Nernst方程，此电极称为指示电极；另一支电极是电位已知并且恒定的所谓参比电极,目前最常用的参考电极有甘汞电极和银-氯化银电极。
离子选择电极法根据标本情况又可分为直接法和间接法。直接法是用离子选择电极直接测定生物体液中的被测物质；间接法则是将标本进行预稀释，然后再进行测定，使得标本的使用量更少。间接法由于将标本进行了预稀释，可以控制其离子强度，也就是控制其活度系数，但间接法由于标本被稀释，测定结果比直接法低。
ISE具选择性好、灵敏度高，、线性范围宽、溶血、脂血及黄疸不影响测定，对有色、浑浊溶液都可进行分析、设备简单，分析速度快，易于自动化，标本用量少等优点，在临床上应用广泛。

三、电泳技术
电泳技术应用广泛，在生物化学实验技术中占有重要地位，主要用于蛋白质、核酸等的分离、鉴定和定量。目前已经发展到自动化的电泳系统，整个电泳过程包括点样、电泳、脱色、扫描定量都实现了自动化操作。同时用半干胶技术取代液体缓冲液，使得电泳操作更规范简便，电泳结果重现性更好。
应掌握电泳的原理、影响因素、各种电泳的特点和使用范围。

四、常用免疫分析技术
随着单克隆抗体的开发和使用、各种标记技术的发展使得免疫学进入了一个新的时期。由于免疫分析技术具有特异性好、快速、灵敏度高等，使得荧光分析法其应用范围十分广泛，在临床生物化学中可以对内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、肿瘤标志物、血药浓度等血清微量物质进行定量测定。
免疫比浊分析分为散射免疫比浊分析和透射免疫比浊分析，应掌握它们的原理、适用条件、影响因素和临床应用。
酶免疫分析是将酶催化的放大作用与抗原、抗体的免疫反应相结合的一种标记免疫分析技术。与放射免疫分析相比其最大优势在于避免了放射性核素对人体的损害、核素标记的抗原或抗体批间差异大，酶标记物具有明显较长的有效期和不需特殊设备等。近年来在EIA中又引进了放大系统，派生出荧光酶免疫分析、增强化学发光酶免疫分析等，使检测的灵敏度大大提高，应用范围不断扩大。应掌握均相EIA和非均相EIA的原理，各种方法的优缺点和应注意的问题。
化学发光免疫分析近十年来得到了很大发展，与微粒子发光免疫分析生物发光免疫分析、增强化学发光分析和电化学发光等以其灵敏度高、检测速度快、操作简便、所用试剂对人体无危害的优点，成为非放射性免疫分析技术中最具有发展前途的方法之一。主要掌握它们的原理和在临床中的应用。
时间分辨荧光免疫分析以镧系元素为标记物，是一种全新的非放射性标记免疫技术和超灵敏度的检测技术。其主要特点是以稀土元素铕（Eu3+）标记抗原或抗体为示踪剂。利用增强液的荧光放大作用和时间分辨荧光测量法排除样品或试剂中非特异性荧光物质的干扰，最大限度地提高了荧光信号测量的特异性和检测方法的灵敏度、操作方法简便、标记物制备容易、稳定性好、不污染环境和易于自动化等优点。

五、其他检验技术
离心机是利用物质的高速旋转时产生强大的离心力，使置于该旋转体中的悬浮颗粒发生沉降或漂浮，从而使某些颗粒达到浓缩或与其他颗粒分离的目的。离心机的种类繁多，用途各异。在使用中应掌握离心力的换算，沉降系数的意义和表示方法，离心机使用中应注意的问题。
高效液相层析法是用特制微粒（<10um）充填的层析柱作为固定相，通过高压使液体流动相快速通过层析柱而达到快速有效分离液相中各种物质的层析技术。它具有分离效果好、分析速度快，检测灵敏度高等特点。在医药卫生和生物化学中得到广泛的应用，蛋白质、糖类、核酸、氨基酸、生物碱、类固醇和类脂等大分子以及高分子聚合物度能用HPLC测定。
放射免疫分析是利用了现代放射性测量技术的高度敏感性和精确性，灵敏度高，是一种超微量的分析技术。同时，由于其分析原理是基于抗原与抗体间高度专一性的结合反应，因而它具有很高的特异性，能从组分十分复杂的样品中准确地测出某一特定组分的含量而不受其它组分的干扰。其分析原理是：用放射性核素标记配体或结合剂，在配体与结合剂之间竞争性或非竞争性的可逆性结合反应，形成配体－结合剂复合物，其反应遵循质量作用定律。放射免疫分析根据结合反应原理及方法学设计原理的不同有许多类型。主要用于激素、微量蛋白等的定量测定，在临床中应用较广。
生物传感器是指固定化的生物体内成分(酶、抗原、抗体、激素等)或生物体本身（细胞、细胞器、组织等）为敏感元件组成的传感器。生物传感器这种新的检测手段与传统的生物化学相比具有以下的主要特点为①生物传感器是用选择性好的生物体材料作为敏感材料，因此一般不需要进行样品的前处理，一般也不需另加其他试剂，使用简便、快速、准确；；②由于它的体积小，可以实现连续在位检测，联机操作；③响应快，样品用量少，且由于敏感材料是固定化的，可以反复多次使用；④传感器连同测定仪器的成本远低于大型的分析仪，便于推广普及。
生物传感器根据利用的生物物质的不同可分为两类。一类是利用酶、细胞内小器官、细胞、组织等具有辅酶特性物质的生物催化传感器。酶传感器、微生物传感器和组织传感器属于此类；另一类是利用抗体、结合蛋白质、激素受体、DNA、RNA等具有亲和性物质的传感器。免疫传感器、受体传感器、DNA传感器属于这类。
生物芯片是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等等生物样品有序地固化于支持物（如玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体）的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速、并行、高效地检测分析，从而判断样品中靶分子的数量、种类等信息。根据芯片上的固定的探针不同，生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，另外根据原理还有元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。如果芯片上固定的是肽或蛋白，则称为肽芯片或蛋白芯片；如果芯片上固定的分子是寡核苷酸探针或DNA，就是DNA芯片。
生物芯片技术应用于疾病的诊断、新药开发、基因测序、基因表达分析、寻找新基因、突变和多态性研究等诸多方面。生物芯片技术虽然还处在初期发展阶段，它的飞速发展正在逐步改变着人们对生物体的认识，随着这一技术的深入发展，它将对临床疾病诊断、疾病发生机理的认识和新药开发都将是一个重要的研究手段。但仍然存在着许多难以解决的问题，例如技术成本昂贵、复杂、检测灵敏度较低，重复性差、分析泛围较狭窄等问题。这些问题主要表现在样品的制备、探针合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等几个方面。